江湖俏佳人剧情讲述了大明国与黑齿国比试四艺而产生的四位俏佳人，因朱王爷篡位而受到迫害，被迫逃亡到扬州，开了一家“姐妹客栈”而后引起的一系列喜剧故事。

　　明朝年间，皇帝忽然奇怪的病重昏迷，朝廷群龙无首，由此而大乱，此时恰逢黑齿国国王黑泥来访，十八太子龙儿(李立饰)只得代父设宴款待来宾。席间，黑泥自夸黑齿国国力强盛到没边，拥有武神、诗神、食神、棋神四大绝世高手，龙儿暗自好笑，因为这四项正是正是汉人的强项，于是双方当即决定一比高下，却不料狡猾又卑鄙无比的黑泥早已买通明国四大高手，龙儿方知中了他的圈套，情急之下，龙儿与黑泥签下契约：三月之后两国比赛，明国若输则割地赔款给黑齿国。

　　一场精心设计而又不为人察觉的选拔比赛在民间悄悄展开了，一番阴差阳错之后，柳员外(梁冠华饰)家的四个女子——从小爱舞刀弄枪的千金柳笑笑(边潇潇饰)、爱棋如命的风骚小妾十三姨(钟丽缇饰)、厨艺精湛的丫环百灵(刘晓靓饰)以及因逃婚而女扮男装的冷秋月(赵子惠饰)进入了龙儿的视线。

　　正当龙儿满心欢喜邀她们进宫共襄大举之际，四个女子却被龙儿的叔叔赵王爷的势力神秘劫走。原来居心叵测、图谋篡位的赵王爷和黑泥早有勾结，欲图谋反篡权，他慌称太子荒淫无度，邀她们进宫只为纳妾以享受私人淫欲，并称太子身上有七七四十九种怪病，吓得柳笑笑等四人仓惶而逃。同时，他又谎报龙儿，称四大高手因为无意为朝廷效命，故中途逃走。

　　龙儿决定带亲信“包打听”小石头微服私访找回四大高手。而在赵王府，黑泥因不满赵王爷放走四女，决定派儿子黑木(杜淳饰)抢在太子之前找到她们，然后一举杀人灭口。

　　柳笑笑、秋月、百灵和十三姨一路坎坷逃到扬州城，十三姨取出自己做歌妓时攒下的私房钱和笑笑等开了一家“姐妹客栈”以维持生计。不久，乔装打扮的龙儿、小石头和黑木也先后找到了“姐妹客栈”，并成为了客栈的伙计。

　　“姐妹客栈”渐渐好名远扬，可却麻烦不断。巡抚大人的公子王俊才住进店内，原来他是为追寻逃婚的小妾冷秋月而来，并拿出冷秋月的卖身契相要挟。为帮助秋月逃脱魔爪，众人决定利用王俊才好色的弱点，让笑笑主动向王俊才示好，王俊才果然上当，乖乖地交出卖身契，笑笑见计划得逞，溜之大吉，之后交给秋月，将其撕得粉碎。

江湖俏佳人剧照

　　“姐妹客栈”众人相处久了，率真的柳笑笑慢慢对智勇双全的黑木渐生好感，而小龙却暗恋娴雅温柔的秋月，于是笑笑只得求教于十三姨，十三姨自诩男人煞星，并答应向笑笑演示如何在十天内搏得男人的欢心，试验的对象恰恰是李长安。

　　果然十天后，李长安被征服，对十三姨大加纠缠。十三姨为了躲避他而回京，却惊悉柳一条要违背当初成亲时候的诺言娶十四姨，伤心绝望之下她决定卖掉“姐妹客栈”和李长安私奔。这时，王功德收买了赶考书生李长安，伺机买下“姐妹客栈”，好夺取“金龙碗”，最后当十三姨得知一切都是阴谋时，终因不堪重击而大病一场，以致于丧失了记忆。

　　为帮助十三姨恢复记忆，笑笑连夜飞鸽唤来父亲柳员外，无奈之中年迈的柳员外(梁冠华饰)不得不对十三姨展开新一轮的追求。

　　之后，“姐妹客栈”又发生了许多有趣而惊险的故事：笑笑的身世之谜，笑笑捉鬼，十三姨智斗赌王，秋月和洋人的友情，百灵忽然丧失味觉。在患难与共中，大黑和小龙成为生死之交，秋月和大黑的爱情也日趋明朗，小龙终于发现原来笑笑才是最适合自己的女孩儿，十三姨最后恢复了记忆，而百灵也和小石头成了一对。与此同时，赵王爷为铲除心头大患，早日谋反篡位成功，借助扬州大旱之际，设下“求雨”圈套，准备在除掉四女同时，一举谋反。不料最后关头笑笑等人险渡难关，赵王爷计划全盘落空。而这时，小龙和大黑的身份也被揭穿，笑笑等终于弄清整个事件的来龙去脉。在黑木的妹妹黑珍珠的最后一次暗杀计划也告失败后，宋国与黑齿国约定的期限也终于到了。

　　比赛中，秋月、百灵、十三姨和柳笑笑齐心合力，凭借高超的技艺出奇制胜，经过一番智慧与意志的较量，最终战胜了对手。赵王爷眼看败局已定，正想拿出“金龙碗(其实是假的)”谋朝篡位，突然，昏迷多日的当朝皇帝突然出现在赛场，原来他早就觉察出赵亲王的不轨之心，佯装病重欲擒故纵，也借此考验太子龙儿的能力，终于，赵亲王等一批奸臣贪官受到了应有的惩罚。明国与黑齿国也重修旧好。

　　不久后，秋月和大黑带着国人从黑齿国来到“姐妹客栈”，小龙也来到这里和笑笑相聚，十三姨也有了身孕，并且全家人从京城搬到了扬州。至此，有情人终成眷属，而“姐妹客栈”的故事也成为了江湖上一段广为流传的佳话。